Efter att den kryoprotektiva perfusionen är klar placeras inte patienten helt enkelt i flytande kväve.
Patienten genomgår ett datorstyrt temperaturprogram som varar flera dagar. Sensorer inne i patienten visar om olika anatomiska regioner kyls tillsammans eller separeras till farliga termiska gradienter.
Teknikproblemet förändras under nedkylningen. Tidig kylning bör begränsa isbildning. Nära och under glasövergången blir precision och termisk likformighet viktigare än hastighet.
Varför kontrollerad kylning är nödvändig
Kryoprotektiva medel minskar den kylningshastighet som krävs för att undvika is. De gör att vattenrika vävnader kan övergå till ett mycket visköst, glasliknande tillstånd istället för att kristalliseras i stor utsträckning.
Den relevanta glasövergångstemperaturen, som skrivs Tg, beror på lösningen, dess koncentration och mätmetoden. Det är ett intervall, inte en universell biologisk tröskel.
För lösningar relevanta för mänsklig kryobevarande ligger detta område ofta nära -120°C till -135°C.
Ovanför det området kan för långsam kylning tillåta isbildning och tillväxt. Under det beter sig materialet alltmer som ett sprött fast ämne.
Om ytan kyls mycket snabbare än mitten kommer olika regioner att dra ihop sig olika mycket. Den resulterande termomekaniska spänningen kan skapa sprickor.
Detta skapar en begränsad väg: kyl tillräckligt snabbt innan glasbildning, sedan kontrollera gradienter och kylningshastighet när patienten blir glaslik.
Seskillnaden mellan frysning och glasbildning för den underliggande fasbeteendet.
Den första generationens kylbox
Tomorrow.bio:s första generationens system, kallat V1 cooling box, etablerade den grundläggande arkitekturen för kontrollerad helkroppskylning.
Patienten placeras inuti en dedikerad isolerad kammare. En dator styr kammarens kryogena miljö medan termoelement mäter temperaturer på flera ställen.
Regulatorn följer en förprogrammerad kurva snarare än att applicera maximal kylning kontinuerligt. Varje sensorsignal sparas som en del av patientens termiska historia.
Detta skiljer sig redan fundamentalt från direkt nedsänkning. Maskinen kan sakta ner, pausa eller ändra kammarens förhållanden som svar på vad patienten faktiskt gör.
Andra generationens dewar-baserade system
Tomorrow.bios andra generationens design flyttar den kontrollerade nedkylningen till en specialbyggd dewar.
Patienten befinner sig kvar inne i dewar:en medan ett specialdesignat lock integrerar nedkylningshårdvaran, datorstyrning, ventiler, sensorkopplingar och termoelementgenomföringar.
Termoelement placeras på flera ställen inne i patienten. Ytterligare sensorer övervakar den termiska miljön inne i dewar:en.
Systemet ser därför mer än den begärda börvärdestemperaturen. Det ser hur snabbt olika mätta regioner i patienten reagerar.
Datorn justerar dewar:ens temperaturgradient och nedkylningshastighet för att hålla dessa avläsningar inom protokollets tillåtna ramar.
En stor kropp kan inte vara perfekt isoterm under nedkylning. Det praktiska målet är att minimera spridningen och förhindra att någon mätt region hamnar farligt långt före eller efter.
Dewar:ens geometri minskar också hanteringen mellan kontrollerad nedkylning och kryogen lagring. Samma slutna form kan ge en stabil, symmetrisk miljö runt patienten.
Börvärdestemperaturen är inte patientens temperatur
En regulator kan göra miljön kall snabbt. Den kan inte få mitten av en mänsklig kropp att omedelbart matcha den temperaturen.
Värme måste vandra från djupare vävnad mot ytan. Geometri, kroppssammansättning, distribution av kryoprotektant och sensorns position påverkar den observerade fördröjningen.
Det är därför en sensorsensor i kammaren inte räcker. En nominell -130°C miljö bevisar inte att varje mätt del av patienten har nått -130°C.
Styrsystemet måste ta hänsyn till både absolut temperatur och skillnaden mellan kanalerna. Den långsammaste punkten, snabbaste punkten och totala spridningen bär var och en på information.
Termoelementens kalibrering, placering och kontinuitet spelar också roll. Orealistiska avläsningar eller sensorfel bör flaggas snarare än tystas genom att medelvärdesbildas in i kurvan.
Tomorrow.bios tre-stegs temperaturprogram
Det nuvarande protokollet har tre distinkta faser. Värdena är driftmål för denna utrustning och kylskyddsmetod, inte universella konstanter för varje vitrifikationssystem.
1. Sänk snabbt mot -130°C
Den första fasen flyttar patienten från torr-is-temperatur mot ungefär -130°C så snabbt som den uppmätta temperaturens spridning säkert tillåter.
Hastighet spelar här roll eftersom oskyddade regioner fortfarande kan bilda is innan vävnaden blir glasartad.
Datorn följer inte bara förfluten tid. Den övervakar termoelementen och justerar den kylande miljön runt patienten.
2. Tillåt en kontrollerad återgång mot -120°C
När du nått ungefär -130°C minskas aktiv kylning och patienten får värmas upp naturligt till ungefär -120°C.
Det här är en glödgande fas. Nära Tg behåller det kryoskyddade materialet tillräcklig molekylär rörlighet för att viss ackumulerad mekanisk spänning ska kunna slappna av.
Uppvärmningen ger också varmare och kallare områden tid att närma sig varandra innan materialet förs djupare in i sitt styva glasartade tillstånd.
Glödgning vänder inte tidigare biologisk skada. Dess syfte är snävare: minska termiska gradienter och de spänningar som skapas av ojämn kontraktion.
3. Sänk till -196°C med ungefär 1°C per timme
Från ungefär -120°C är den önskade sänkningen ungefär 1°C per timme tills patienten når flytande kvävetemperatur.
Det där sista 76-gradersintervallet tar ungefär tre dagar även innan hållpunkter och kontrolljusteringar räknas in.
Att upprätthålla 1°C per timme i en stor, termiskt heterogen kropp är ett kontrollproblem, inte bara en tidsinställning.
Regulatorn måste kontinuerligt justera dewar-miljön så att de interna termoelementen sänks tillsammans utan att skapa alltför stora gradienter.
När ett område halkar efter kan det att tvinga miljön kallare överkyla ett annat område. Precision innebär att balansera hela sensorfältet, inte att jaga en enskild avläsning.
Varför den glödgande fasen är vetenskapligt rimlig
Storskalig vitrifieringsforskning identifierar två konkurrerande felfall: otillräcklig kylning ovanför Tg och överdriven mekanisk spänning runt och under Tg.
En2024 studie av mänskliga organ i full skala använde flera interna prober och drog slutsatsen att glödgning minskar gradienter innan materialet går in i den glasartade fasen.
Samma studie fann att långsam kylning under glödgningsområdet hjälper till att undvika att stora gradienter och spänningar byggs upp igen.
Separattermomekanisk forskning fann att glödgning nära Tg väsentligen förändrar kvarvarande spänning och försvagar dess beroende av den föregående kylhastigheten.
Dessa studier stödjer den underliggande kontrollstrategin. De validerar inte självständigt varje exakt inställning i Tomorrow.bios hela kroppsprotokoll.
Helkroppar är större och mer heterogena än laboratorielösningar eller organ. Direkt temperaturmätning och avbildning efter nedkylning förblir nödvändiga.
Det som datorn registrerar
Den användbara utdata är inte ett meddelande som säger 'nedkylning klar'. Det är hela tidsserien från varje temperatursensor.
Registreringen bör visa hastigheter, hållpunkter, återhämtningar, gradienter mellan sensorer, regulatoråtgärder, larm och eventuella avvikelser från den planerade kurvan.
Dessa data blir en del avkvalitetsbedömningen av kryopreservering.
Efter nedkylning kan standardiserad CT vid flytande kvävetemperatur undersöka distributionen av kryoprotektant, is, grova deformationer och sprickor som temperaturen ensam inte kan avslöja.
Varför avsluta vid flytande kvävetemperatur
Vid normalt atmosfärstryck kokar kväve nära 77.34 kelvin, ungefär -195.8°C, enligtNIST Chemistry WebBook.
Lagring i flytande kväve är passiv. Så länge tillräckligt med vätska finns kvar i behållaren, upprätthåller dess kokande jämvikt en stabil kryogen miljö utan mekanisk kylning.
Den kontrollerade nedstigningen avslutas först när patienten är termiskt redo för det stabila tillståndet. Lagring används inte som ersättning för nedkylning.
Utformningen och avvägningarna för nästa steg behandlas imoderna kryogena dewar och lagring vid intermediär temperatur.
TL;DR: Tomorrow.bio använder datorstyrd kylning och interna temperatursensorer. Processen kyler snabbt nära glasbildning, lindrar termisk stress, och sjunker sedan långsamt mot -196°C.
Utforska det här praktiska verktyget
Använd det interaktiva verktyget för att undersöka frågan i den här artikeln.
Laddar det interaktiva verktyget...
Fördjupad läsning