Efter den krioprotektiva perfusionen placeras patienten inte bara rakt ner i flytande kväve.
Patienten genomgår ett datorstyrt temperaturprogram som pågår i flera dygn. Sensorer inuti patienten visar om olika kroppsregioner kyls ner i takt eller om det uppstår farliga temperaturskillnader mellan dem.
Kylningens tekniska utmaning ändras under förloppet. Den inledande kylningen ska begränsa isbildning. Nära och under glasövergången blir precision och termisk jämnhet viktigare än hastighet.
Varför kontrollerad nedkylning krävs
Krioprotektiva medel sänker den kylhastighet som krävs för att undvika isbildning. De gör att den vattenrika vävnaden kan övergå i ett mycket trögflytande, glasliknande tillstånd i stället för att kristallisera i stor omfattning.
Den relevanta glasövergångstemperaturen, betecknad Tg, beror på lösningen, dess koncentration och mätmetoden. Det är ett intervall, inte en enda universell biologisk gräns.
För lösningar som används vid human kryopreservering ligger detta intervall vanligen mellan -120°C och -135°C.
Ovanför det intervallet kan för långsam kylning tillåta att is bildas och växer. Under det beter sig materialet alltmer som en spröd, fast substans.
Om ytan kyls betydligt snabbare än kärnan drar de olika regionerna ihop sig olika mycket. Den termomekaniska spänningen som uppstår kan orsaka sprickor.
Det skapar en snäv väg att följa: kyl tillräckligt snabbt innan vitrifieringen inträder, och styr sedan gradienter och kylhastighet noggrant medan patienten övergår i glastillstånd.
Se skillnaden mellan frysning och vitrifiering för det underliggande fasbeteendet.
Den första generationens kylbox
Tomorrow.bios första generations system, kallat V1-kylboxen, lade grunden för arkitekturen bakom kontrollerad nedkylning av hela kroppen.
Patienten placeras i en särskild isolerad kammare. En dator styr kammarens kryogena miljö medan termoelement mäter temperaturen på flera platser.
Styrsystemet följer en programmerad kurva i stället för att kyla maximalt hela tiden. Varje sensorkanal registreras som en del av patientens termiska historik.
Redan detta skiljer sig i grunden från att sänka patienten direkt i flytande kväve. Maskinen kan sakta ner, pausa eller ändra förhållandena i kammaren utifrån vad som faktiskt sker med patienten.
Andra generationens dewarbaserade system
Tomorrow.bios andra generations design flyttar den kontrollerade nedkylningen in i en specialbyggd dewar.
Patienten ligger kvar i dewaren medan ett specialiserat lock integrerar kylutrustning, datorstyrning, ventiler, sensoranslutningar och genomföringar för termoelement.
Termoelement placeras på flera platser inuti patienten. Ytterligare sensorer övervakar den termiska miljön inne i dewaren.
Systemet registrerar därmed mer än det begärda börvärdet. Det ser hur snabbt olika uppmätta regioner av patienten svarar på kylningen.
Datorn justerar dewarens temperaturgradient och nedkylningshastighet för att hålla mätvärdena inom protokollets tillåtna gränser.
En stor kropp kan inte kylas helt jämnt. Det praktiska målet är att minimera spridningen och förhindra att någon uppmätt region ligger farligt före eller efter de andra.
Dewarens utformning minskar också hanteringen mellan kontrollerad nedkylning och kryogen förvaring. Samma slutna form kan ge en stabil, symmetrisk miljö runt patienten.
Börvärdestemperatur är inte patientens temperatur
Ett styrsystem kan snabbt göra omgivningen kall. Det kan inte få mitten av en människokropp att omedelbart nå samma temperatur.
Värme måste ledas från djupare vävnad ut mot ytan. Kroppens form och sammansättning, spridningen av krioprotektant och sensorernas placering påverkar alla den fördröjning som observeras.
Det är därför en enda sensor i kammaren inte räcker. En nominell omgivningstemperatur på -130°C bevisar inte att varje uppmätt del av patienten faktiskt har nått -130°C.
Styrsystemet måste beakta både den absoluta temperaturen och skillnaden mellan kanalerna. Den långsammaste punkten, den snabbaste punkten och den totala spridningen ger var sin viktig information.
Kalibrering, placering och kontinuitet hos termoelementen spelar också roll. Orimliga avläsningar eller sensorfel bör flaggas, inte tystas ner genom att medelvärdesberäknas in i kurvan.
Tomorrow.bios treстеgade temperaturprogram
Det nuvarande protokollet består av tre tydliga faser. Värdena är driftmål för just denna utrustning och detta krioprotektiva tillvägagångssätt, inte universella konstanter för alla vitrifieringssystem.
1. Snabb nedkylning mot -130°C
Den första fasen sänker patientens temperatur från torrisnivå mot cirka -130°C, så snabbt som den uppmätta temperaturspridningen tillåter utan risk.
Hastigheten spelar roll här eftersom otillräckligt skyddade regioner fortfarande kan bilda is innan vävnaden hunnit övergå i glastillstånd.
Datorn följer inte enbart förlupen tid. Den övervakar termoelementen och justerar kylmiljön kring patienten löpande.
2. Kontrollerad återstigning mot -120°C
Efter att patienten nått cirka -130°C minskas den aktiva kylningen, och patienten tillåts stiga i temperatur naturligt mot cirka -120°C.
Detta är en annealingfas. Nära Tg har det krioprotektiva materialet fortfarande tillräcklig molekylär rörlighet för att en del av den ansamlade mekaniska spänningen ska kunna avta.
Återstigningen ger också varmare och kallare regioner tid att jämna ut sig innan materialet förs djupare in i sitt stelnade glastillstånd.
Annealing gör inte om redan uppkommen biologisk skada. Syftet är mer begränsat: att minska temperaturskillnader och de spänningar som ojämn sammandragning skapar.
3. Nedkylning till -196°C i cirka 1°C per timme
Från cirka -120°C är målet en nedkylningshastighet på ungefär 1°C per timme tills patienten når flytande kvävets temperatur.
Det sista intervallet på 76 grader tar omkring tre dygn, redan innan pauser och kontrolljusteringar räknas in.
Att hålla 1°C per timme i en stor, termiskt ojämn kropp är ett styrningsproblem, inte bara en tidsinställning.
Styrsystemet måste löpande justera miljön i dewaren så att de interna termoelementen sänker temperaturen i takt utan att för stora gradienter uppstår.
När en region hamnar efter kan en kallare omgivning kyla ner en annan region för mycket. Precision handlar om att balansera hela sensorfältet, inte om att jaga en enskild avläsning.
Varför annealingfasen är vetenskapligt rimlig
Storskalig vitrifieringsforskning pekar ut två motstridiga riskzoner: otillräcklig kylning ovanför Tg och alltför stor mekanisk spänning kring och under Tg.
En vitrifieringsstudie från 2024 i organskala hos människa använde flera interna mätsonder och drog slutsatsen att annealing minskar gradienter innan materialet övergår i glasfas.
Samma studie fann att långsam kylning under annealingintervallet bidrar till att förhindra att stora gradienter och spänningar byggs upp på nytt.
En annan termomekanisk studie fann att annealing nära Tg förändrar den kvarvarande spänningen avsevärt och gör den mindre beroende av den föregående kylhastigheten.
Dessa studier stöder den underliggande styrstrategin. De bekräftar inte oberoende varje enskilt börvärde i Tomorrow.bios protokoll för hela kroppen.
Hela människokroppar är större och mer heterogena än laboratorielösningar eller enskilda organ. Direkta temperaturregistreringar och avbildning efter nedkylningen är fortfarande nödvändiga.
Vad datorn registrerar
Det användbara resultatet är inte ett meddelande om att ”nedkylningen är klar”. Det är den fullständiga tidsseriens data från varje temperaturkanal.
Registreringen bör visa hastigheter, pauser, återstigningar, gradienter mellan sensorer, styrsystemets åtgärder, larm och eventuella avvikelser från den planerade kurvan.
Dessa data blir en del av kvalitetsbedömningen av kryopreserveringen.
Efter nedkylningen kan en standardiserad datortomografi vid flytande kvävets temperatur upptäcka fördelning av krioprotektant, is, grov deformation och sprickor som temperaturdata ensamma inte kan visa.
Varför nedkylningen avslutas vid flytande kvävets temperatur
Vid normalt atmosfärstryck kokar kväve vid cirka 77,34 kelvin, ungefär -195,8°C, enligt NIST Chemistry WebBook.
Förvaring i flytande kväve är passiv. Så länge det finns tillräckligt med vätska kvar i kärlet håller kokjämvikten en stabil kryogen miljö utan mekanisk kylning.
Den kontrollerade nedkylningen avslutas först när patienten är termiskt redo för det stabila tillståndet. Förvaringen ersätter inte nedkylningen.
Utformningen av och avvägningarna kring nästa steg beskrivs i moderna kryogena dewarer och mellantemperaturförvaring.
Kort sagt: Tomorrow.bio använder datorstyrd kylning och interna temperatursensorer. Processen kyler snabbt nära glasbildningen, avlastar termisk spänning och sänker därefter temperaturen långsamt mot -196°C.
Utforska det här praktiska verktyget
Använd det interaktiva verktyget för att undersöka frågan i den här artikeln.
Laddar det interaktiva verktyget...
Vidare läsning